编辑/宇航员伊万
       ——【·前言·】——
       所以改善稻米储存蛋白质的营养品质、食品加工和促进健康的特性非常重要。
       而这便需要对蛋白小体结构与功能的基本了解，稻米种子中主要的蛋白质是谷蛋白，稻米与其他主要的谷类作物不同，它特殊之处在于同时积累麦角蛋白和谷蛋白，
       这两种蛋白质都是稻米的主要储存蛋白质成分。


       在稻米种子中，麦角蛋白沉积在内质网衍生的蛋白小体中，而谷蛋白和球蛋白，则沉积在液泡衍生的蛋白小体中。
       为此，有学者证明了mRNA定位机制负责麦角蛋白，和谷蛋白在特定内质网亚域的差异合成，以及它们在不同细胞内储存区的分类，
       麦角蛋白mRNA富集在PB-ER中，而谷蛋白mRNA则靶向于Cis-ER。


       ——【·植物材料·】——
       采用传统种植方法，在稻田和塑料盆中种植了野生类型品种Koshihikari，以及球蛋白和谷蛋白突变体的水稻。
       成熟后，收集种子，并在盆栽实验中，
       从主茎上除去了出现的分蘖，以监测主茎穗的发育阶段。


       在开花后的7、14、21、28和35天，收集了发育中的种子，并立即储存在冷冻库中。
       然而，来自日本国家农业西部地区研究中心的稻米，却发现了这类稻米，属于球蛋白和谷蛋白突变组合的突变水稻品种，
       这种突变体K×433具有一个球蛋白缺失的隐性突变。
       该突变引发了包括GluB1/GluB2/GluB4在内，GluB亚基的RNAi抑制，突变体LGC-Jun具有Lgc1和glb1突变，Lgc1和glb1分别
       来自乙烯亚胺和γ射线处理的群体
       。


       其他谷蛋白突变体则是通过乙基甲磺酸盐，或γ射线处理的群体，进行鉴定的的样品缓冲液提取的，用于常规的SDS-PAGE分析，亦或者不含ME用于非还原性SDS-PAGE，
       水稻谷蛋白则是用含有1%乳酸和1mMEDTA的提取液进行提取。
       先用含有35mMKPi(pH7.6)缓冲液、0.4MNaCl和60%正丙醇去除白蛋白、球蛋白和谷蛋白，提取液中的谷蛋白溶于溶解缓冲液中，该缓冲液含有9.5M尿素，2%TritonX-100，5%巯基乙醇和5%Bio-Lyte3–10，
       用于2D-PAGE分析
       。


       ——【·SDS–PAGE、2D-PAGE和蛋白质印迹分析·】——
       SDS-PAGE的程序进行，稍作修改，使用固定电压200V下14%的丙烯酰胺/N，N’-亚甲基双丙烯酰胺凝胶，非平衡pH梯度凝胶电泳按照别的学者的方法进行。
       第一维电泳在200V下进行15分钟，300V下进行15分钟，400V下进行15分钟，500V下进行15分钟，750V下进行5小时。


       第二维电泳采用了较高温度的SDS-PAGE方法，按照别的学者的方法在恒定温度45°C、恒定电压200V下进行80分钟，免疫印迹采用了之前的报告中提到的方法，简要地说，经过SDS-PAGE和2D-PAGE分离的蛋白质经电泳，转移至硝酸纤维膜上。
       在室温下进行实验操作，首先将膜与阻断溶液、脱脂奶粉、0.05%Tween-20和pH7.4的0.04M磷酸钠缓冲液轻轻摇动孵育1小时。
       接着将膜与抗谷蛋白的一抗单独或逐步孵育1小时
       。


       然后用含有TBSTNaCl和0.05%Tween-20的溶液彻底洗涤膜，每次洗涤20分钟，共洗涤三次。
       紧接着使用NBT和BCIP进行显色，待显色达到要求后，停止显色并将膜沥干、晾干后进行扫描。


       ——【·谷蛋白亚基特异性抗体·】——
       为了产生特异性抗体，针对谷蛋白α多肽的特定肽段进行比较，选择了11S球蛋白家族四个变异区域中的五个位点作为抗原表位。
       这些位点包括GluA1的位点II、GluB1的位点IV-b、GluB4的位点III、GluB4的位点IV-a以及GluB4的位点IV-b。


       当这些位点位于α多肽的C-末端可变区域上游和时，研究人员会使用抗-A1和抗-B1，特异地与GluA1/GluA2和GluB1/GluB2发生反应。
       而抗-B4则专门与GluB4发生反应，
       需要注意的是，抗-B4也会对GluB4的可能部分降解形式产生较弱的信号。


       ——【·水稻胚乳的显微和共聚焦激光显微镜检查·】——
       当未成熟稻瘿孢霉经过冷冻后，研究人员会将其切成半块，然后用2%戊二醛溶液。
       在pH7.3的0.1M磷酸钠缓冲液中固定约3小时，将样品连续用梯度乙醇溶液脱水两次，每次脱水30分钟，脱水完成后，
       将样品浸入L.R.White树脂中固定约16小时
       。


       为了使样品聚合，将样品转移到聚合胶囊中，加入L.R.White树脂，并在55°C下孵育约2-3天，为了得到薄切片，使用超薄切片机和玻璃刀切割嵌入的样品，
       然后将薄切片转移到玻璃载玻片上晾干。
       薄切片随后使用0.25%Cbb在50%甲醇和10%醋酸中染色，并在CX31显微镜下观察，用于共聚焦激光显微镜的切片，来自未经固定的7、14和35天后冷冻样品。
       随后使用retoratomeREM-710和electrofreezeMC-802A，以及Tissue-TekO.C.T.化合物进行制备。


       在切片经过乙酸酯、PBS和阻断缓冲液处理后，接着使用一抗和二抗，一抗是
       稀释1000倍的抗谷蛋白A1抗体，以及稀释2000倍的抗α球蛋白抗体
       。
       二抗是
       稀释500倍的抗小鼠IgG偶联FITC，和稀释2000倍的抗兔子IgG偶联Cy3。
       洗涤PBS后，使用共聚焦激光显微镜FV1200BX61观察切片。


       ——【·实验结果·】——
       在球蛋白积累和非积累突变体之间，种子萌发、植物生长和淀粉积累没有明显的表型差异，在球蛋白缺失突变体LGC-Jun中发现了一个新的32kDa条带，
       根据别的学者的研究，这被认为是谷蛋白。
       由于球蛋白通常积累在谷蛋白体II的周围，并且在球蛋白缺失突变体K×433中，观察到变形的PB-II，推测球蛋白参与了谷蛋白的积累，采用对角线二维凝胶电泳，分析了球蛋白缺失突变对谷蛋白结构的影响。
       该方法可以区分含有亚多肽间二硫键的蛋白质，和含有亚单肽内二硫键的蛋白质，当通过这种二维凝胶电泳对总种子蛋白进行分析时，谷蛋白和球蛋白几乎完全分布在中心对角线线条的左右两侧，而缺乏二硫键的蛋白质则在对角线上检测到。


       在这里检测到的四个水稻品种/系列中的任何一个，谷蛋白在第一方向以单体[(α+β)]和聚合物[(α+β)n]的形式水平划分，然后谷蛋白亚单位在第二方向上，
       垂直分离为α和β亚肽。
       当比较越光和K×433，以及05TK470和05TK464之间的斑点分布模式时，可以清楚地检测到位于单体谷蛋白α亚肽正下方的新斑点，并且在更低位置也能模糊地检测到，还可以明显看到一个与β亚肽分子大小相似的新斑点，位于单体谷蛋白β亚肽和对角线之间。
       由于向中心对角线线条左侧迁移的斑点很可能是谷蛋白，上述结果表明在球蛋白缺失突变体中发生了部分降解，其中α亚肽与完整的β亚肽共价连接，请注意，正下方的新α亚肽斑点可能是单体谷蛋白，并且球蛋白缺失突变体中单体谷蛋白，与聚合谷蛋白的比例似乎增加了。


       从野生型Koshihikari和球蛋白/谷蛋白突变体K×433、05TK470和05TK464，在非还原条件下提取的总蛋白质，与此同时，含有亚单肽内二硫键的球蛋白
       ，由于在还原条件下迁移受阻，被检测到在对角线线条的右侧，没有二硫键的多肽沿着对角线线条迁移。
       谷蛋白在第一方向上分离为非聚合单体亚单位[(α+β)]和聚合亚单位[(α+β)n]，然后在第二方向上分离为α和β多肽，在球蛋白缺失突变体中发现的可能的新α和β多肽斑点，分别用箭头和箭头标记。
       由于在谷蛋白组分中提取到了新的32kDa条带，因此对球蛋白缺失和/或谷蛋白突变体的谷蛋白组分，进行了非平衡pH梯度电泳分离，然后再进行SDS-PAGE，结果显示，在球蛋白缺失突变体K×433中，观察到了几个新的斑点和较低水平的斑点。


       尽管NEPHGE无法准确显示多肽的等电聚点，但是X3、X1/X4和X5的pI似乎分别对应于GluA1、GluB2和GluB1的α多肽的pI，斑点X2的pI较为碱性，X1的分子大小略小于GluB2的α多肽，X3、X4和X5的大小相似，而X2的大小稍小。
       斑点X2-X5对应于新的32kDa条带，新的斑点也在其他球蛋白缺失突变体中被检测到，只有在05TK464中检测到了X1、X2和X3，在LGC-Jun中观察到了X3、X4和X5
       ，因为05TK464缺乏GluA1/GluA2，而LGC-Jun缺乏GluB1/GluB2/GluB4。
       推测X4/X5与GluA1/GluA2有关，而X1/X2与GluB1/GluB2/GluB4有关，在所有检测的球蛋白缺失突变体中都检测到了新的斑点X3，表明X3与GluA3有关，如果这个解释是正确的，那么GluA3的α多肽的这种大小/电荷改变，是第一个明显的观察到的不完全影响GluA3积累的突变。


       值得注意的是，在LGC-1和LGC-Jun中，除了GluA1/GluA2/GluA3之外的次级亚单位的存在变得相对更明显，因为通过RNAi严重抑制了GluB亚单位的积累，在稻谷谷蛋白中，
       类似其他11S球蛋白家族蛋白，α多肽的C-末端存在超变区。
       超变区在X射线晶体学分析中不可见，被认为位于分子表面，因此可以被蛋白酶接触到，假设α多肽的C-末端发生了部分降解，从而导致无球蛋白突变体中新斑点的形成，换句话说，斑点X3和X4/X5分别来自GluA3和GluA1/GluA2的部分降解。
       而斑点X1/X2则来自GluB1/GluB2/GluB4的部分降解，为了确认上述假设，采用了逐步免疫检测的方法，使用GluB4亚单位特异性抗体和可区分其变异区的抗体，对05TK470和05TK464进行NEPHGE/SDS-PAGE分析。


       分析结果显示，抗B4只与斑点B4反应，抗B4(No.4a)与斑点X1反应而不与斑点X2反应，而抗B4与斑点X2反应，上述观察结果表明，斑点X1和X2至少部分来源于GluB4，
       斑点X1的C-末端缩短，斑点X2的C-末端更短。
       抗B4和抗B4是针对GluB4α多肽C-末端的32-39残基，和2-11残基的表位制备的，暗示这些表位区域在斑点X2和X1中发生了降解，由于X3/X4/X5的分子量与X2相似，推测在X3/X4/X5中发生了与X2相当的区域的部分降解。
       需要注意的是，不排除斑点X1和X2也来自GluB1/GluB2，为了了解粒子发育过程中部分降解发生的时间，使用抗A1和抗B4对Koshihikari和K×433，进行了完整和部分降解多肽的积累时间的研究。


       用Cbb染色检查时，谷蛋白从开花后7天开始积累，并逐渐增加，到21或28天达到最大量，Westernblotting显示，GluA1、GluA2和GluB4的完整α多肽中标记为A1、A2和B4，从开花后7天开始检测到，并在大约28-35天达到最高水平。
       与此同时，7天开始检测到部分降解带X1，并在21天达到最大值，从14天开始检测到部分降解带X4/X5，并在21天达到最大值，需要注意的是
       ，通过部分降解带与完整带的丰度比例估计的部分降解速率，在GluB4中似乎比在GluA1/GluA2中高得多。
       X1条带的积累水平与B4相等或超过，而X4/X5的丰度明显低于A1/A2的水平，这种部分降解速率的差异，可能影响谷蛋白亚基之间部分降解条带出现的时间差异，在无球蛋白的突变体中，GluB4和可能的GluA1/GluA2，似乎从种子成熟的早期阶段开始受到蛋白酶的攻击。


       ——【·结论·】——
       在大多数亚洲国家，稻谷是主要的主食作物，对于发展中国家来说，改善种子蛋白质的营养价值是一个期望实现的目标，而对于发达国家来说，由于患肾综合征的人数不断增加，低消化蛋白质含量越来越受到关注。
       为了解决这两个问题，需要对种子储藏蛋白质有更深入的基础知识，在稻谷储藏蛋白质突变体中，一些蛋白质的缺失或抑制被假设为被其他储藏蛋白质所补偿，
       以毛细管电泳这种适用于准确定量的技术，对一些谷蛋白亚基突变体进行了先前的分析。
       结果显示，Type1、Type2、Type3和a-123less这些突变体中的GluB4、GluA2、GluA1及其三个亚基的缺失，并没有明显引起其他谷蛋白的组成和总蛋白质含量的改变，这表明这些缺失被其他储藏蛋白质，均匀地进行了补偿。


       LGC-1是通过RNA干扰抑制谷蛋白B型亚基的突变体，这种突变体积累了较高水平的球蛋白和13kDa谷蛋白，总氮含量类似，表明种子储藏蛋白质具有功能冗余和灵活性，
       有学者制备的谷蛋白、球蛋白和谷蛋白敲除系列显示。
       一种或几种储藏蛋白质的减少主要是通过其他具有硫富集，或硫贫的特点的储藏蛋白质来进行补偿的，在这项研究中，球蛋白缺失突变却引起了谷蛋白的部分降解，而不是补偿，尽管RNAi引起的蛋白体结构变化已经在玉米、小麦和稻谷中得到证明。
       但部分降解的情况尚未被报道，根据结果以及球蛋白在PB-II表面的积累，以及其缺失导致PB-II结构异常的事实，球蛋白保护着谷蛋白不受蛋白酶消化，从而促进稳定的谷蛋白积累，缺乏球蛋白的突变并未在萌发、植物生长和贮藏物质积累方面表现出任何其他异常。


       因此在常规栽培过程中没有明显的缺陷表现，可能需要在不同条件下检查具有异常PB-II的种子的性能，例如更具挑战性和不利的环境。
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